Fils de l’acteur et metteur en scène Georges Wilson, Lambert Wilson baigne dès l’enfance dans le milieu artistique. Il se forme au Drama Centre de Londres de 1975 à 1978. Après des débuts au cinéma en 1977 dans Julia de Fred Zinnemann, il obtient deux ans plus tard son premier rôle dans un film français avec Le Gendarme et les Extra-Terrestres, de Jean Girault. Sa carrière s’installe vraiment avec La Boum 2 (Claude Pinoteau, 1982), puis La Femme publique (Andrzej Żuławski, 1984) et Rendez-vous (André Téchiné, 1985). Il joue ensuite dans des films de Peter Greenaway (Dans le ventre de l’architecte), Claude Chabrol (Le Sang des autres), Alain Resnais (On connaît la chanson, Pas sur la bouche, Cœurs, Vous n'avez encore rien vu), James Ivory (Jefferson à Paris), Xavier Beauvois (Des hommes et des dieux), Valérie Lemercier (Palais royal !), Valeria Bruni Tedeschi (Il est plus facile pour un chameau…), Bertrand Tavernier (La Princesse de Montpensier), les Wachowski (Matrix Reloaded, Matrix Revolutions, Matrix Resurrections) ou Émilie Deleuze (Cinq Hectares).
Lambert Wilson mène parallèlement une carrière active au théâtre – où il a fait ses débuts en 1978 dans Les Derniers de Gorki. Également chanteur, il étudie le répertoire de la comédie musicale américaine et enregistre un album consacré aux grands standards du genre, Musicals, en 1989. Il commence en 1990 une collaboration avec le pianiste Bruno Fontaine qui donne naissance à des récitals mêlant la chanson française aux standards de comédie musicale. Il joue et chante aussi dans A Little Night Music de Stephen Sondheim et dans Singin’ in The Rain. En 2006, il participe à Candide de Bernstein mis en scène par Robert Carsen, au Théâtre du Châtelet à Paris et à la Scala de Milan.
En tant que récitant, il prête son talent à de grandes partitions du répertoire classique auprès de chefs tels que Seiji Ozawa, Georges Prêtre, Charles Dutoit, Kent Nagano, Franz Welser Möst et Valery Gergiev.